2 × zmes Pfu PCR

Šablóna A-1

■ Šablóna obsahuje proteínové nečistoty alebo inhibítory Taq, atď. - Purifikujte templát DNA, odstráňte proteínové nečistoty alebo extrahujte templátovú DNA pomocou purifikačných súprav.

■ Denaturácia templátu nie je úplná - —Vhodne zvýšte denaturačnú teplotu a predĺžte denaturačný čas.

■ Degradácia šablóny ——Pripravte šablónu.

A-2 Primer

■ Nízka kvalita primerov-Znovu syntetizujte primer.

■ Degradácia základného náteru --— Kvôli konzervácii rozdeľte priméry s vysokou koncentráciou do malého objemu. Vyhnite sa viacnásobnému zmrazovaniu a rozmrazovaniu alebo dlhodobému zmrazovaniu v 4 ° C.

■ Nesprávny dizajn primerov (napr. Dĺžka primeru nie je dostatočná, dimér vytvorený medzi primermi atď.) -Prepracovať priméry (vyhnite sa tvorbe diméru priméru a sekundárnej štruktúry)

A-3 Mg²⁺koncentrácia

■ Mg²⁺ koncentrácia je príliš nízka —— Správne zvýšte Mg²⁺ koncentrácia: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrácia sériou reakcií od 1 mM do 3 mM s intervalom 0,5 mM na stanovenie optimálneho Mg²⁺ koncentrácia pre každý templát a primer.

A-4 Teplota žíhania

■ Vysoká teplota žíhania ovplyvňuje viazanie základného náteru a templátu. —— Znížte teplotu žíhania a optimalizujte stav s gradientom 2 ° C.

A-5 Čas predĺženia

■ Krátky čas predĺženia —— Predĺžte čas predĺženia.

Javy: Negatívne vzorky tiež ukazujú pásy cieľovej sekvencie.

A-1 Kontaminácia PCR

■ Krížová kontaminácia cieľovej sekvencie alebo amplifikačných produktov ——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————— opatrné opatrenie: vzorku Činidlá alebo zariadenie by sa mali autoklávovať, aby sa odstránili existujúce nukleové kyseliny, a existencia kontaminácie by sa mala určiť pomocou experimentov s negatívnou kontrolou.

■ Kontaminácia reagencií ——Reagenty rozoberte a skladujte pri nízkej teplote.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentrácia je príliš nízka —— Správne zvýšte Mg²⁺ koncentrácia: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrácia sériou reakcií od 1 mM do 3 mM s intervalom 0,5 mM na stanovenie optimálneho Mg²⁺ koncentrácia pre každý templát a primer.

■ Nesprávny dizajn primeru a cieľová sekvencia má homológiu s necieľovou sekvenciou. ——Re-design primerov.

Javy: PCR amplifikačné pásy nie sú v súlade s očakávanou veľkosťou, buď veľké alebo malé, alebo sa niekedy vyskytujú špecifické amplifikačné pásy aj nešpecifické amplifikačné pásy.

Základný náter A-1

■ Slabá špecificita primeru

——Re-design primer.

■ Koncentrácia priméru je príliš vysoká - —Vhodne zvýšte denaturačnú teplotu a predĺžte denaturačný čas.

A-2 Mg²⁺ koncentrácia

■ Mg²⁺ koncentrácia je príliš vysoká —— Správne znížte koncentráciu Mg2+: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrácia sériou reakcií od 1 mM do 3 mM s intervalom 0,5 mM na stanovenie optimálneho Mg²⁺ koncentrácia pre každý templát a primer.

A-3 Termostabilná polymeráza

■ Nadmerné množstvo enzýmu - Množstvo enzýmu primerane znížte v intervaloch 0,5 U.

A-4 Teplota žíhania

■ Teplota žíhania je príliš nízka —— Vhodne zvýšte teplotu žíhania alebo použite dvojstupňovú metódu žíhania

A-5 PCR cykly

■ Príliš veľa cyklov PCR - Znížte počet cyklov PCR.

Základný náter A-1—— Slabá špecifickosť —— Znovu navrhnite základný náter, zmeňte polohu a dĺžku základného náteru, aby ste zvýšili jeho špecifickosť; alebo vykonajte vnorenú PCR.

DNA templátu A-2

——Šablóna nie je čistá —— Purifikujte templát alebo extrahujte DNA purifikačnými súpravami.

A-3 Mg²⁺ koncentrácia

——Mg²⁺ koncentrácia je príliš vysoká —— Správne znížte Mg²⁺ koncentrácia: Optimalizujte Mg²⁺ koncentrácia sériou reakcií od 1 mM do 3 mM s intervalom 0,5 mM na stanovenie optimálneho Mg²⁺ koncentrácia pre každý templát a primer.

A-4 dNTP

——Koncentrácia dNTP je príliš vysoká —— Znížte vhodne koncentráciu dNTP

A-5 Teplota žíhania

—— Príliš nízka teplota žíhania —— Vhodne zvýšte teplotu žíhania

A-6 Cykly

——Príliš veľa cyklov ——Optimalizujte počet cyklov

Prvým krokom je výber vhodnej polymerázy. Bežná Taq polymeráza nemôže byť skontrolovaná kvôli nedostatku aktivity 3'-5 'exonukleázy a nesúlad výrazne zníži účinnosť predĺženia fragmentov. Bežná Taq polymeráza preto nemôže účinne amplifikovať cieľové fragmenty väčšie ako 5 kb. Taq polymeráza so špeciálnou modifikáciou alebo iná vysoko verná polymeráza by mala byť zvolená tak, aby sa zlepšila účinnosť extenzie a splnili potreby amplifikácie dlhých fragmentov. Okrem toho amplifikácia dlhých fragmentov tiež vyžaduje zodpovedajúcu úpravu konštrukcie priméru, času denaturácie, času predĺženia, pH pufra atď. K lepšiemu výťažku môžu obvykle viesť priméry s 18 až 24 bp. Aby sa zabránilo poškodeniu templátu, denaturačný čas pri 94 ° C by sa mal skrátiť na 30 sekúnd alebo menej na cyklus a čas na zvýšenie teploty na 94 ° C pred amplifikáciou by mal byť kratší ako 1 minúta. Efektívnu amplifikáciu dlhých fragmentov môže zaistiť aj nastavenie teploty predĺženia na približne 68 ° C a návrh času predĺženia podľa rýchlosti 1 kb/min.

Chybovú rýchlosť amplifikácie PCR je možné znížiť použitím rôznych DNA polymeráz s vysokou vernosťou. Spomedzi všetkých doposiaľ nájdených Taq DNA polymeráz má enzým Pfu najnižšiu chybovosť a najvyššiu vernosť (pozri priloženú tabuľku). Okrem výberu enzýmov môžu vedci ďalej znižovať rýchlosť mutácií PCR optimalizáciou reakčných podmienok vrátane optimalizácie zloženia pufra, koncentrácie termostabilnej polymerázy a optimalizácie počtu cyklov PCR.